LAPORAN 1 (Isolasi Acetobacter xylinum Pada Media Cair Fermentasi Nata de Coco )

VI.       PEMBAHASAN

 

Laporan ini akan membahas hasil praktikum Isolasi Acetobacter xylinum pada media cair fermentasi Nata de Coco yang telah dilaksanakan pada tanggal 22 Agustus 2011.

            Bakteri Acetobacterium xylinum dapat diisolasi dari media cair fermentasi nata dengan menggunkan metode screening (penapisan). Metode screening terbagi menjadi beberapa tahap, tapi umunya terbagi dalam dua tahap yaitu tahap primer atau penduga dan tahap sekunder atau penguat. Pada tahap primer screening dapat dilakukan dengan cara tuang (pour plate) atau cara gores (streak plate) pada lempeng agar. Media yang digunakan untuk mengisolasi Acetobacter dapat bersifat selektif (Glucose Yeast Extract Agar, media Hestrin & Schram, dll). Pada tahap sekunder dilakukan pengamatan melalui mikroskop, dengan melakukan pewarnaan gram untuk memastikan kemurnian dari isolat tersebut. Cara membuat media selektif untuk Acetobacterium xylinum yaitu dengan memanaskan 1 L air kelapa hingga mendidih. Kemudian ditambahkan 15 gram bataco agar, 1,5 gram ammonium sulfat, 1,5 gram asam sitrat, yang di campur hingga pH-nya 4.

Isolasi adalah suatu cara untuk memisahkan satu mikrobia dari mikrobia lainnya yang bertujuan untuk mendapatkan spesies tunggal dengan sifat-sifat yang diinginkan. Untuk mengetahui jenis mikroorganisme yang hidup dalam bahan pangan dapat dilakukan isolasi mikrobia, dengan cara menggoreskan suspensi campuran sel pada suatu media padat di dalam cawan petri kemudian menginkubasikannya, sehingga setiap sel akan tumbuh membentuk koloni dan memudahkan untuk memisahkannya. (Cappuccino & Sherman, 1983). Isolasi adalah suatu metode untuk memisahkan mikroorganisme dalam medium menjadi sel yang individu yang disiapkan untuk mendapatkan spesies tunggal. (Atlas, 1984). Pada prinsipnya percobaan isolasi dimulai dengan membuat suspensi bahan sebagai sumber mikrobia. Lalu suspensi tersebut dituangkan atau digoreskan (dengan menggunakan jarum ose steril) pada media yang sebelumnya telah disediakan terlebih dahulu. (Hadioetomo,1993).

Dalam pengertian mikrobiologi secara umum, mengisolasi artinya memisahkan suatu spesies mikroorganisme tertentu dari organisme lain yang umum dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni. Biakan murni ialah biakan yang sel-selnya berasal dari pembelahan satu sel tunggal. Pengisolasian untuk mendapatkan biakan murni ini diperlukan, karena semua metode mikrobiologis yang digunakan untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri kultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Hadioetomo, 1993).

            Pada praktikum ini akan dilakukan isolasi Acetobacterium xylinum dari media cair fermentasi nata de coco, menggunakan cara tuang dan cara gores pada lempeng agar media selektif (hasil modifikasi), untuk selanjutnya diamati dengan mikroskop.

Sebanyak 1 ml media cair fermentasi nata de coco diencerkan menggunakan 9 ml larutan buffer fosfat sampai pengenceran 10-6. Kemudian sebanyak 1 ml suspensi dari pengenceran 10-5 dan 10-6 di masukkan ke dalam 2 buah cawan petri yang di tambahkan media PCA dengan menggunan metode tuang. Kemudian diinkubasi pada suhu 300C selama 2 hari. Amati jumlah, bentuk dan warna koloninya. Kemudian hitung nilai SPC dan dilanjutkan dengan pewarnaan gram. Setelah dilakukan pewarnaan gram, amati dibawah mikroskop. Kelemahan dari metode tuang yaitu media agar tersebut sudah mulai membeku saat akan menuangkan media agar ke dalam cawan petri yang berisi 1 ml suspensi.

Setelah melakukan isolasi dengan metode tuang selesai, lanjutkan isolasi dengan cara gores. Media PCA beku pada cawan petri dan media cair fermentasi nata de coco disiapkan terlebih dahulu. Kemudian sebarkan secukupnya media cair fermentasi nata de coco dengan menggunakan pipet ukur. Setelah itu gores dengan menggunakan loop secara kuadran. Kemudian diinkubasi pada suhu 300C selama 2 hari. Amati jumlah, bentuk dan warna koloninya. Kemudian hitung nilai SPC dan dilanjutkan dengan pewarnaan gram. Setelah dilakukan pewarnaan gram, amati dibawah mikroskop.

Hasil pengamatan isolasi Acetobacterium xylinum dari media cair fermentasi nata de coco dapat dilihat pada Tabel 1 dan Tabel 2.

Tabel 1. Penghitungan Jumlah Koloni Bakteri

Kel

Pengenceran

SPC

Keteranagan

Streak

10-5 10-6

IA

1

 

2

< 3,0 x 106

(1,0 x 105)

Hasil <30, Hitung pengenceran

10-5

(terdapat kapang yang tumbuh pada pengenceran 10-5)

1

2A

0

1

2

3A

174

167

1,7 x 107

Hitung pengenceran terendah karena  = 9,6 (>2)

4

4A

92

74

9,2 x 106

Hitung pengenceran terendah karena   = 8,0 (>2)

13

Sumber: Dokumentasi pribadi, 2011

Menurut Fardiaz (1992), untuk melaporkan hasil analisis mikrobiologi dengan cara hitungan cawan digunakan suatu standar yang disebut Standart Plate Counts (SPC). Ketentuannya adalah sebagai berikut :

 

  • Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 dan 300.
  • Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan koloni yang besar di mana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni.
  • Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni

Menurut Fardiaz (1992), dalam SPC ditentukan cara pelaporan dan perhitungan koloni, diantaranya sebagai berikut :

  • Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka yaitu angka pertama (satuan) dan angka kedua (desimal). Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua.
  • Jika pada semua pengenceran dihasilkan kurang dari 30 koloni pada cawan petri, berarti pengenceran yang dilakukan terlalu tinggi. Oleh karena itu, jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung.
  • Jika pada semua pengenceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri, berarti pengenceran yang dilakukan terlalu rendah. Oleh karena itu, jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan faktor pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung.
  • Jika pada cawan dari dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni dengan jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan dua, dilaporkan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan faktor pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil.

Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu. Oleh karena itu, harus dipilih tingkat pengenceran yang menghasilkan kedua cawan duplo dengan koloni di antara 30 dan 300.

Tabel 2. Gambar Pengamatan Bakteri

Kel

Keterangan

Pengenceran

Streak (gores)

10-5

10-6

1A

Gambar

Keterangan

Basil gram negative

Coccus, gram negatif

Coccus, gram negative

Dugaan bakteri

Acetobacter xylinum

Pseudomonas

Pseudomonas

2A

Gambar

Keterangan

Basil, gram negatif

Coccus, gram negative

Dugaan bakteri

Acetobacter xylinum

Pseudomonas

3A

Gambar

Keterangan

Basil, gram negative

Basil, gram negatif

Basil, gram negative

Dugaan bakteri

Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum

4A

Gambar

Keterangan

Basil, gram negative

Basil, gram positif

Basil, gram positif

Dugaan bakteri

Acetobacter xylinum

Bacillus

Bacillus

Sumber: Dokumentasi pribadi, 2011

Pengamatan bentuk dan ukuran sel koloni bakteri akan tampak jelas jika dilakukan pewarnaan terhadap sel. Teknik pewarnaan gram harus sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi antara gram positif dan gram negatif.  Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu atau biru. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan lugol, larutan alkohol (bahan pemucat) 95%, dan zat pewarna berupa zat warna safranin.

Sebelum dilakukan pewarnaan gram, yang harus dilakukan adalah membuat apusan bakteri terlebih dahulu. Cara membuat apusan bakteri yaitu, pertama nyalakan bunsen terlebih dahulu. Pada setiap pengerjaan mikrobiologi usahakan untuk bekerja didekat bunsen agar lingkungan tetap steril dan menghindari kontaminan. Setelah menyalakan bunsen, sterilkan gelas objek dengan kapas atau tisu yang sudah diberi alkohol 70%. Perhatikan serabut kapas yang ada di gelas objek, jangan sampai tertinggal satu helaipun serabut kapas karena dapat mengganggu pada saat melakukan pengamatan bentuk bakteri di bawah mikroskop. Kemudian lalukan gelas objek di sekitar api bunsen yang menyala untuk memastikan kesterilan gelas objek. Setelah itu oleskan akuades steril terlebih dahulu pada gelas objek dengan menggunakan ose loop setipis mungkin. Kemudian ambil sampel dengan menggunakan ose loop steril pada permukaan media PCA. Setelah itu oleskan sampel setipis mungkin pada gelas objek dengan penyebaran yang merata. Kemudian lakukan fiksasi dengan cara melalukan gelas objek di atas api secara cepat.

Setelah apusan bakteri kering dilanjutkan dengan pewarnaan gram. Cara pewarnaan gram yaitu, pertama teteskan pewarna Kristal violet selama satu menit di atas film pada gelas objek. Kemudian bilas dengan akuades dengan cara membilas gelas objek pada posisi miring. Kemudian keringkan setelah kering tetesi dengan lugol selama satu menit lalu bilas kembali dengan akuades dan keringkan. Setelah kering hilangkan warna pada gelas objek dengan menggunakan alkohol 95% selama 10 – 20 detik lalu bilas dengan akuades dan keringkan kembali. Kemudian warnai dengan larutan safranin selama 20 detik lalu bilas dengan akuades dan keringkan dengan kertas serap atau tisu. Setelah pewarnaan selesai, siapkan cover glass dan bersihkan dengan menggunakan kapas atau tisu yang sudah di beri alkohol 70%. Kemudian letakkan cover glass di atas bakteri yang telah di warnai dan lakukan pengamatan di bawah mikroskop. Setelah semuanya dilakukan sesuai prosedur, pewarnaan gram tersebut akan menghasilkan warna merah dan ungu atau biru. Bakteri yang diwarnai dengan pewarnaan gram ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet sehingga akan terlihat berwarna ungu di bawah mikroskop. Sedangkan bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan pada saat diberi zat pewarna safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

Biakan Acetobacter xylinum merupakan suatu bahan yang paling penting dalam pembentukan nata. Bakteri ini secara alami dapat ditemukan pada sari tanaman bergula yang telah mengalami fermentasi atau pada sayuran dan buah-buahan bergula yang sudah membusuk. Gallardo et al, 1971 telah berhasil mengisolasi bakteri nata dengan cara memasukan bagian-bagian buah-buahan dan sayuran yang telah membusuk ke dalam tabung reaksi yang telah berisi medium cair steril dari larutan TPYS (Tomatto Peptone Yeast Sucrose).

Acetobacterium xylinum merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang, obligat aerobik, non-motil, dan tidak membentuk endospora. Acetobacterium xylinum tumbuh pada suhu mesofilik, dengan suhu optimum pertumbuhan 28-30oC. Apabila di tumbuhkan pada media yang mengandung gula (glukosa), maka bakteri ini dapat memfermentasi glukosa dengan membentuk suatu polisakarida sebagai selulosa ekstraseluler (disebut nata). Acetobacterium xylinum juga disebut sebagai bakteri asam asetat karena selain dapat mengoksidasi gula juga mengahasilkan asam asetat dari etanol.  Berdasarkan hasil pengamatan pewarnaan gram pada Tabel 2, hanya kelompok 3A yang berhasil mengisolasi bakteri Acetobacterium xylinum tanpa diganggu oleh kontaminan seperti Pseudomonas pada kelompok 1A dan 2A serta Bacillus pada kelompok 4A. Kemungkinan kontaminan tersebut dapat tumbuh karena pengerjaan pada saat melakukan isolasi yang tidak steril.

Nata de coco merupakan produk makanan yang terbuat dari sari buah kelapa ditambah dengan bahan lain seperti gula, asam asetat glasial dan starter. Dengan bantuan Acetobacter xylinum komponen gula yang terdapat dalam substrat diubah menjadi suatu bahan yang menyerupai gel dan terbentuk di permukaan medium (Widia, 1984). Lebih lanjut substrat yang terbentuk adalah selulosa bakteri yang mengandung air sekitar 98% dengan tekstur agak kenyal dan konsistensi tegar. Sebagai produk pangan, nata de coco mengandung serat yang tinggi, sangat baik untuk sistem pencernaan, rendah kalori, dan tidak mengandung kolesterol (Trade dan Enviroment Database, 2004). Jonas (2004) menambahkan bahwa kandungan serat dalam nata de coco dapat membantu pencernaan dan mengurangi terkena resiko kanker usus.

Komponen serat yang terbentuk dalam nata de coco adalah selulosa bakteri. Selulosa merupakan struktur utama dinding sel (McDonald et al. 1988) berupa rantai panjang residu glukopyranosa yang berikatan β-(1-4) tanpa cabang dan tanpa subtitusi (Hatfield, 1989). Sejumlah besar rantai selulosa bergabung membentuk mikrofibril selulosa dan saling berikatan membentuk fibril (Morrison, 1986). Rantai selulosa dapat mempunyai residu lebih dari 1500 residu β-glukosa (McDonald et al. 1988). Rantainya mengandung gugus OH disepanjang rantainya yang menyebabkan selulosa bermuatan negatif. Dengan demikian, selulosa memiliki kemampuan dalam mengikat ion positif seperti pada mineral.

Apabila dilihat dari aspek gizi, nata tidak mempunyai peran yang penting karena komponen utamanya adalah selulosa, akan tetapi nata berguna untuk membantu gerak peristaltik usus besar sehingga akan memperlancar pengeluaran feses. Maka nata dapat digambarkan sebagai sebagai makanan rendah energi untuk keperluan diet. Nata memiliki kandungan selulosa ± 2,5% dan 95% kandungan air. Nata juga memiliki kandungan serat kasar 2,75%; protein 1,5 -2,8%; lemak 0,35% dan sisanya air. Aktivitas pembuatan nata hanya terjadi pada kisaran pH antara 3,5-7,5. Sedangkan pH optimum untuk pembentukan nata adalah 4. Suhu yang memungkinkan untuk pembentukan nata adalah pada suhu kamar antara 28-320C.

Bakteri yang berperan dalam pembuatan nata yaitu Acetobacter xylinum akan merubah gula pada medium menjadi selulosa. Acetobacter xylinum dapat merubah 19% gula menjadi selulosa. Selulosa yang terbentuk dalam media tersebut berupa benang-benang yang bersama-sama polisakarida membentuk jalinan yang terus menerus menebal menjadi lapisan nata . Sintesa polisakarida oleh bakteri sangat dipengaruhi oleh tersedianya nutrisi dan ion-ion tertentu yang dapat mengkatalisasi aktivitas bakteri. Peningkatan konsentrasi nitrogen dalam subtrat dapat meningkatkan jumlah polisakarida yang terbentuk, sedangkan ion-ion bivalen seperti Mg2+ dan Ca2+ diperlukan untuk mengontrol kerja enzim ektraselluler dan membentuk ikatan dengan polisakarida tersebut.

Acetobacter xylinum dapat menghasilkan bau asam pada nata, karena bakteri ini merupakan bakteri asam asetat yaitu bakteri yang dapat mengoksidasi gula atau alkohol menjadi asam asetat dan selanjutnya mengoksidasi asam asetat menjadi CO2. Maka dari itu sebelum mengkonsumsinya, nata de coco harus direbus terlebih dahulu untuk menghilangkan kadar asam asetat dalam nata de coco tersebut.

VII.     KESIMPULAN

 

Kesimpulan dari praktikum isolasi Acetobacter xylinum pada media cair fermentasi Nata de Coco kali ini adalah sebagai berikut:

  • Acetobacterium xylinum merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang, obligat aerobik, non motil, dan tidak membentuk endospora. A. Xylinum tumbuh pada suhu mesofilik, dengan suhu optimum pertumbuhan 28 – 30o C.
  • Praktikan yang gagal mengisolasi bakteri Acetobacter xylinum dikarenakan tidak menjaga kesterilan alat dan lingkungan kerjanya.
  • Terdapat kelemahan dari metode tuang, yaitu media PCA sudah mulai membeku saat akan menuangkannya ke dalam cawan petri yang berisi 1 ml suspensi media cair fermentasi nata de coco.


DAFTAR PUSTAKA

 

Atlas, R.M. 1984. Microbiology: Fundamentals and Applications. MacMillan Publishing Company. New York.

 

Cappucino, J. G. & N. Sherman. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Addison-Wesley Publishing Company. Massachusetts.

 

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

 

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikobiologi Dasar Dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

 

Hatfield, R.D. 1989. The effects of barley, unmolases supplements on organic matter, nitrogen and fibre digestibility. Agron. J. Vol. 81:33-38.

 

Jonas. 2004. Nata de Coco (Coconut gle) : A healthy satisfaction. Available at http://www.jonas.com.ph/nata.html (diakses tanggal 3 September 2011).

 

McDonald, P., R.A. Edward and J.F.D. Greenhalg. 1988. Animal Nutrition Forth Ed. Logman Scientific and Technical and John Willey & Sons, Inc. New York.

 

Marrison, I.M. 1986. Factors affecting the breakdown of dietary fiber in the rumen. Hannah Res. Institute. 89-96.

 

Trade and Environment Database. 2004. Nata de coco Boom and the Philipphines. Available at http://www.american.edu/projects/mandala/TED/coconut.htm (diakses tanggal 3 September 2011).

 

Widia, I.W. 1984. Mempelajari Pengaruh Penambahan Skim Milk, Air Kelapa, Jenis Gula dan Mineral pada Pembuatan Nata de Coco. Karya Ilmiah, Institut Pertanian  Bogor.

 

JAWABAN PERTANYAAN DAN DISKUSI

 

  1. Berdasarkan pengamatan, apakah prosedur yang dilakukan menjamin keberhasilan untuk mengisolasi bakteri A. Xylinum dari media cair nata de coco ?

Jawab :

Prosedur yang dilakukan untuk mengisolasi bakteri A. Xylinum dari media cair nata de coco sebenarnya sudah benar dan bisa dilakukan. Yang lebih menjamin keberhasilan sebenarnya adalah teknis pada saat pelaksanaan serta kesterilan dalam pengerjaan karena isolasi bakteri Acetobacter xylinum ini  harus dilakukan dengan steril.

  1. Bagaimana tingkat keberhasilan isolasi yang dilakukan? Mengapa demikian?

Jawab :

Isolasi yang dilakukan ada yang berhasil yaitu pada metode gores, tetapi tidak pada metode tuang karena saat akan menuangkan media agar ke dalam cawan petri, media agar tersebut sudah mulai membeku serta praktikan kurang mampu menjaga kesterilan lingkungan kerja.

 

  1. No trackbacks yet.

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s

%d blogger menyukai ini: